F a c e b o o o k

Print Friendly and PDF 

舊瓶新酒:層光螢光顯微術

  撰文者:莊翔淯、羅健榮 (中央大學物理系)  2016-11-23
  點閱次數:1899


光學顯微鏡一直都是生物研究中的物理利器,透過幾片神奇的玻璃,能讓我們看到微生物和細胞。從虎克和雷文霍克奠定了顯微鏡的基礎,之後又因為斯托克斯發現了螢光並且廣泛的被研究及應用,使得生物研究的方法越來越和螢光與顯微術變得密不可分。科學界一路追求解析度之下,進一步發展出超高解析螢光顯微術而突破一般顯微鏡的光學解析極限。可惜的是,螢光照明的方式與高解析成像時的淺景深使得螢光顯微術應用上受到限制。另外,生物學上的研究,也從單一細胞的尺度,逐漸增加到多細胞與組織,甚至於完整個體的尺度。許多科學家開始探索另一個可能性,是否能逐層照明來掃描樣本。層光螢光顯微術(Light sheet fluorescent microscopy)帶給這些整體細胞研究一個可能的未來。

顯微鏡的起源

大家回想起小時候的上自然課時,必定有一堂課是教導我們用顯微鏡觀察微觀尺度下的生物,並且寫下觀察紀錄或是描繪其樣子。不管是地上爬的或是水裡游的生物們,都成為我們迫不及待想觀察的目標。彷彿微觀世界有著許多神秘的故事一般。我們都知道,顯微鏡的發明在今日的醫學或是生物等相關領域佔有重要的一席,因為科學的第一步始於觀察,所以「看的到」的這件事是非常重要。更何況又是可以直接用肉眼觀察到,其對觀察者的衝擊與影響更巨大。

顯微鏡的歷史可以追溯到1665年,英國皇家科學院院士(FRS),羅伯特.虎克(Robert Hooke)發表了「顯微圖譜(Micrographia)」-有關他所觀察到的生物的樣貌。在其書中,可以找到他用來觀察的顯微鏡設計手稿(圖一(a)),除此之外,還有他根據顯微鏡下觀察到的生物所畫的影像,像是跳蚤(圖一(b))或是軟木塞內被他稱之為細胞(Cell)的格子狀結構(圖一(c))[1]

另一位也被列為顯微鏡始祖的雷文霍克(Antonie Philips van Leeuwenhoek)是荷蘭的一位布商,並且他沒有受過正式的科學教育。然而,可能是對微觀世界的好奇,在他工作閒暇之餘,他學習研發許多顯微鏡的製作技術,像是透鏡的研磨或是額外的技巧。雷文霍克受到許多當時科學家的尊崇,其原因在於:他是第一位觀察到細菌並紀錄下的人;以及在不論像差的前提下,他所磨製的透鏡解析能力可以高達1微米[1]

(a)

(b)

(c)

圖一虎克所發表的「顯微圖譜」手稿。(a)顯微鏡設計圖。(b)跳蚤。(c)軟木塞。

螢光的發現

在顯微鏡下想看到這些微觀尺度的物體,光源當然是不可或缺。但是,如果是用穿透式的光源照明,那麼在細微結構觀察上會因為對比度不好,而造成觀察上的吃力。其中一個很大的原因是,生物細胞樣本通常沒有顏色,而且光學性質與水的差異不大,造成對比度的不明顯。

舉個例子來說,就像是你在汽車車燈前面晃動一根螢光棒,想看到他的結構是件十分困難的事情,反倒是在一片黑暗中,螢光棒本身發光,卻能夠輕易地被發現。或是在太陽光下,看不到星星,但是到了晚上,卻可以清楚看到星星。所以對比度是光學觀察上非常重要的一件事。因此,如果有種方法只讓被觀察的物體散射光或是發光,減低背景光,那麼對比度就能大大提升,觀察就會變得相對容易。

歷史追朔到1852年,物理學家和數學家-喬治.斯托克斯爵士(Sir George Gabriel Stokes, PRS)發現了「螢石」的存在。最大特別之處在於-「如果這礦物被短波長照射,那麼它則會放出另一個波長較長的光」。因此,斯托克斯便將這現象命名為「螢光(Fluorescence)」[1]。螢光的發光機制在物理學上能夠被量子力學所解釋。當基態(Ground state)的電子受到激發(Excitation),便會躍遷到激發態(Excitation state),然後在激發態的電子會降到單重態(Singlet state),然後再進一步回到基態放出光(Emission)。由於放射光與激發光的波長不同,所以我們可以利用不同波長的濾片來篩選我們需要的光來觀察影像。另外可以利用化學鍵節或是生物基因方法,把螢光分子或是螢光蛋白銜接在目標的蛋白質或是組織上,我們就可以利用螢光的高對比度來觀察特定的目標物。

在過去幾十年,螢光被大量的設計並且廣泛的使用到生物研究上,原因就是在於螢光在生物標定上專一性高,影像對比度高。除此之外,螢光除了用來標定結構之外,也可以用來當作一把尺,舉例來說:Fröster resonance energy transfer (FRET)-就是透過兩個螢光蛋白靠得非常近(大約幾個nm),其中一個螢光蛋白放射光誘發另一個螢光蛋白發光,透過FRET公式回推距離;或是一台三用電錶量測膜電位(Membrane potential),舉例來說:Photo-induced electron transfer(PeT)-就是當特定離子結合到螢光物質上時,能階產生變化而進一步放出螢光的[2]。總而言之,螢光所能應用的事情是非常廣泛的。

(a)

(b)

(c)

圖二(a)螢光能階機制(b)FRET理論示意圖(c) PeT原理機制

 

「螢光顯微術」-結合螢光和顯微術,逐漸在生物研究上佔有一席之地。不論是利用化學鍵結或是基因銜接,越來越多的生物研究依賴螢光顯微術。更甚者,數種超高解析螢光顯微術將我們從微米帶到奈米的解析度,在2014年,諾貝爾化學獎頒獎給此技術的貢獻。(細節請詳見物理雙月刊37卷,第1期-從微米到奈米:光學顯微術的一大步)。

然而,螢光技術也不是完美無缺,例如光漂白(Photobleach)會造成螢光失效。另外激發光的照明型式,也會大大影響拍照的品質。一般使用螢光顯微術做超高解析通常樣品都會有一個主要限制:薄樣品。原因在於,螢光顯微鏡的激發光源是和樣品擺放方向垂直,所以如果是厚的樣品,那麼激發光一照,全部的螢光分子都會發光,那麼在觀察的焦平面影像將會加在一個很亮的背景上,造成細微結構的對比度不夠;除此之外,非觀察平面上的螢光也會提早被曝光(圖三(a)),而導致螢光的光漂白。所以,如果今天的激發光源能夠從側邊進來,並且薄薄一片激發光源,那麼便可以解決厚樣品在螢光顯微鏡使用上的劣勢,並且還能夠避免在非焦平面的螢光被光漂白(圖三(b))。

(a)

(b)

圖三(a)一般螢光顯微鏡照明光方向和螢光被激發示意圖。(b) 層光螢光顯微術概念示意圖。

層光螢光顯微術

層光螢光顯微術(Light sheet fluorescence microscopy, LSFM)便是一套能夠克服以往螢光顯微鏡缺點的方法,也有人稱之為”選定平面照明顯微術” (Selective/single plane illumination microscopy, SPIM)。其主要精神在於,產生片狀照明光從側面打入,只激發焦平面上的螢光發光。因此,在影像對比方面將獲得很大的提升。層光顯微術發展可以追溯到1903年,Siedentopf and Zsigmondy為了觀察金粒子打造了一台超顯微鏡(ultramicroscope)(圖四(a)),將陽光從側面打入狹縫中照射在樣品上。本質上這是一台暗視野顯微鏡,可以觀察到膠體粒子散射出來的光。Zsigmondy也因研究膠體粒子而獲得1925年諾貝爾化學獎。[3]

此篇論文並沒有刺激更多的層光顯微術技術的出現。直到1993年,由Voie和他的團隊發展出一套光學系統,orthogonal plane fluorescence optical sectioning (OPFOS),其架設上最主要的差異是-使用了柱狀透鏡(Cylindrical lens)。柱狀透鏡最大的特點在與光波前只會讓其中一軸發散或是匯聚,因此,就可以產生一個很細又很平廣的照明光(圖四(b))。

(a)

(b)

(c)

圖四(a) 超顯微鏡(ultramicroscope)手稿示意圖(b)使用柱狀透鏡產生產生一個很細又很平廣的照明光(c) 層光螢光顯微術的主要硬體架構

最基本的層光螢光顯微術在架構(圖四(c))上都會有一面圓柱透鏡和一顆物鏡(低倍率)產生片狀照明光源,並且在另一個垂直於光前進的方向上設置另一顆接收螢光的物鏡(高倍率)。由於我們都知道光經過透鏡聚焦,短焦長的透鏡聚光快,發散也快;相反地,長焦長的透鏡聚得比較慢,但是發散得也比較慢。又因為此技術目標是觀察大體積的生物樣本(相較於單細胞來說),所以用來照明的片狀光源必須要比較廣,因此通常會搭配低倍率的顯微物鏡做聚光鏡。因此在這樣的系統架設下,便可以拍攝到層層生物體樣本影像切片,最後在重建影像即可得到生物體完整的影像(圖五)。

(a)

(b)

圖五使用LSFM系統拍攝到不同深度的斑馬魚(Zebrafish)影像切片,然後再重建立體影像(引用於:Pitrone, P.G., et al., OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth, 2013. 10(7): p. 598-599.)

然而,層光螢光顯微術主要是用來解決拍攝大體積生物的光學技術,所以可以想到的是,這個影像絕對不是擷取個一兩張就可以解決的。假設當我們今天想要量測生物動態的變化,例如某些機能隨時間的變化,那麼使用目前的架設就是讓樣品移動掃描(圖六(a))。可是讓載物台整體移動不僅費時且較不穩定,若是可以讓切片照明光做移動(圖六(b))加上有變焦的收光物鏡(圖六(c)),那麼除了樣品更穩定之外,還可以讓大體積掃描的速率獲得更大的提升。

圖六照明物鏡與偵測物鏡相對移動示意圖。(a)照明光源與偵測系統固定位置,移動樣品。(b)照明光源移動與偵測鏡頭移動,樣本固定。(c) 照明光源移動,樣本固定,利用變焦鏡頭觀測。[4]

振鏡與變焦鏡頭

隨著材料科技的發展以及機械的精度提升,有兩種滿好用的工具能夠解決我們所遇到的問題-振鏡(Galvo mirror)與變焦鏡頭(Tunable lens)。先來說振鏡(圖七(a)),他主要是由兩個檢流馬達和兩面平面鏡所組成,藉由兩個馬達控制兩個角度(),便可控制光線前進的徑向方向()。而變焦鏡頭,則是藉由上下兩片電極板,藉由電壓控制壓緊或是鬆放,讓液體能夠流入或是流出,讓中間的曲率不同而導致聚焦的焦長不同。由於這些工具都是透過電子訊號,因此在擷取訊號傳遞是十分快速的,而使得層光螢光顯微術在拍攝動態的效率上獲得很大的提升。

(a)

(b)

圖七振鏡(Galvo mirror)和變焦鏡頭(Tunable lens)結構及其工作原理示意圖

因此,在2013年,由Florian O. Fahrbach團隊發表了一篇有關使用變焦鏡頭讓層光螢光顯微術速度提升的方法,其中測試的樣品是,斑馬魚的心臟(註:斑馬魚的心臟跳動頻率約2 Hz,大小約200 μm),圖八是他們所獲得的結果。[4]

(a)

(b)

圖八藉由振鏡以及變焦鏡頭優化層光螢光顯微術系統,以斑馬魚(Zebrafish)的心臟做為測試樣品,其影像結果

多重層光螢光顯微術

雖然層光螢光顯微術看似一套完美的光學影顯微技術,但是仍然不可避免有些缺陷的存在。主要問題還是大型樣品厚度所造成的問題,如圖九(2.c.)和圖九(2.d),你會發現由於光在前端被散射掉部分,所以導致樣品的兩側光強度會不均勻。除此之外,由於層光顯微術是一層一層的照光,在樣品的重建上會看到像圖九(2.a),會有一層一層的條紋結構。於是,在2007年,便由Jan Huisken和Didier Y. R. Stainier提出多重層光顯微術(Multi-SPIM)的概念。原理上相當簡單,就是讓光從原本單一方向照明,現在多出其他方向的照明光,這樣就可以減少照明不均勻,同時也解決條紋的問題(圖九(2.b)和(e))。[5]

(1)

(2)

圖九層光顯微術(SPIM)與多重層光顯微術(mSPIM)。(1)系統照明概念示意圖。(2)拍攝結果比較,多重層光顯微術可得到較均勻的成像效果。

 

單一物鏡法

需求的提升與技術的發展會將我們帶到更極限的地方。層光螢光顯微術已經改善了大部分的問題,然而,從影像做分析的研究人員,當然會想要能夠看到更小的尺度,雖然我們能解析的尺度被繞射極限所規範,但是我們仍然可以巧妙運用一些方法去重建那些遺失的光訊號。近年來發展出像是結構照明顯微術(Structured illumination microscopy, SIM)[6]和時間隨機性影像(Super-resolution optical fluctuation imaging, SOFI)[7]。然而,為了能夠蒐集到最大量的物體螢光訊號,需要高倍率且數值孔徑(Numerical aperture,NA)較大的顯微物鏡,同時也意指顯微物鏡需要很短的工作距離。但是,數值孔徑值越大就表示鏡頭的前端需要較大的集光區,鏡頭前端較鈍,所以使用兩顆鏡頭互相垂直的層光螢光顯微術(圖四(c))就很難實現。因此就有人提出能否使用一顆顯微物鏡同時當作切片光的照明和收螢光的鏡頭。在2015年,Galland就提出了圖十(b)的想法[8]:在樣品上面建構一塊45度的反射鏡,只要移動顯微物鏡,就能將目標物的整體做完整的掃描。

(a)

(b)

圖十(a)數值孔徑與鏡頭前端的關係示意圖(b)LSFM使用單一鏡頭概念及其掃描方法示意圖

 

晶格層光顯微術

2014年艾力克.貝齊格博士(Eric Betzig)由於他所發展的光啟動定位顯微術(Photoactivated localization microscopy, PALM)超高解析螢光顯微術獲得諾貝爾化學獎。同年,他又表新的晶格層光顯微術(Lattice light sheet microscopy)的技術。貝齊格博士認為螢光顯微術在生物影像的應用主要受限於四個因素:空間解析尺度要夠小,取樣能力要夠快,光傷害要最小,深度要能夠最深入。而原本由他所發展的光啟動定位顯微術,雖然可以大大提升空間解析度到奈米持度,但在活體生物樣本的應用有眾多缺點。這套晶格層光顯微術之所以能夠吸引到眾人的目光其原因便是在這四個因素中取得了最佳平衡點位置:使用層光(Light sheet)避免螢光照久的光傷害還同時提升了樣品的縱向的解析力;並藉由產生具有空間結構的晶格層光(Lattice light sheet)的照明光作為快速掃描的方法,搭配結構照明顯微術(SIM)的技術來使橫向解析力的提升。因此,這套技術不但有著3D超高解析影像還同時具備觀看活體細胞的快速取樣能力,所以這個技術完全掌握空間和時間的所有細節,也充分利用到結構照明和層光顯微術的優點。[9]

層光顯微鏡資源

為了讓各個領域的研究人員都可以快速使用這套光學方法,便有一些光學相關的公司提供半成品的模組,像是ASI(Applied Scientific Instrumentation)公司提供模組化配件(圖十一(a))可以直接和現有的顯微鏡做搭配組合。或是可以藉由一個小巧的設計(圖十一(b))達到只使用一顆物鏡便可以做層光螢光顯微術,例如直接利用原本的雷射掃描式共軛焦顯微鏡升級使用。當然,如果手上沒有那麼多經費或是你想從頭到腳自己打造一臺,那麼你可以考慮OpenSPIM(Open Selective Plane Illumination Microscopy),這是一個開放的資源,在他們的網頁上你可以看到架設所需的光學元件清單和架設的教學影片,也可以根據自己的需求作系統的變更與設計。

(a)

(b)

圖十一(a) ASI的iSPIM模組(b) Leica TCS SP8 DLS在顯微物鏡上搭配一個反射裝置來產生light sheet的照明光

未來: 速度與3D影像分析

層光螢光顯微術是一套可以用來觀看大型物體的螢光顯微技術,且可以重建出三維(3D)影像。但也因此,數據量將由原來的二維增加到三維,若要維持一樣的空間細膩程度,數據量勢必會大增。在觀測與紀錄上,三維影像的是一個嚴厲的挑戰,因此當需要獲取觀察目標在時間上的資訊,那麼相機的取樣率就是必須要考慮的重要因素。一則發展高速相機,二則利用軟體處理動態模糊(motion blur)的問題。除此之外,光經過任何一個光學元件或是樣品,都會因為曲率或是折射率不一致產生像差。像差對影像最明顯的影響就是對比度下降以及光強的減少,所以此時可以靠調適光學(Adaptive optics)的方法做修正。由於調適光學的方法是透過偵測波前的光,系統再及時給予一個弭補的回饋機制,因此背後的演算機制也比須在時間上獲得大幅度的提升運算速度,否則拍攝速度將會因此受到大幅度限制。可以想見分析數據的上也會從以往的二維增加到三維。在數據儲存,分析與演算法上都會是新的挑戰。

綜上所述,層光螢光顯微術重新應用了層光的概念,讓生物顯微技術再上一層樓,可以擴大我們對於更複雜生物體的研究。雖然說這一個顯微術有許多優勢存在,但是同時也具有再實際應用上的問題,未來仍需靠各領域的人繼續優化這套技術。


Reference

1.         Milestones in light microscopy. Nat Cell Biol, 2009. 11(10): p. 1165.

2.         Miller, E.W., et al., Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012. 109(6): p. 2114-2119.

3.         Santi, P.A., Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2011. 59(2): p. 129-138.

4.         Fahrbach, F.O., et al., Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Optics Express, 2013. 21(18): p. 21010-21026.

5.         Huisken, J. and D.Y.R. Stainier, Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). Optics Letters, 2007. 32(17): p. 2608-2610.

6.         Neil, M.A.A., R. Juškaitis, and T. Wilson, Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Optics Letters, 1997. 22(24): p. 1905-1907.

7.         Dertinger, T., et al., Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009. 106(52): p. 22287-22292.

8.        Galland, R., et al., 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Meth, 2015. 12(7): p. 641-644.

9.         Betzig, E., Single Molecules, Cells, and Super-Resolution Optics (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl, 2015. 54(28): p. 8034-53.


作者:羅建榮(國立中央大學物理系 副教授),莊翔淯 (國立中央大學物理系與生物物理所)

 

 



Search