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在顯微鏡下拍一場高速電影:透過慢動作重播窺探生物系統的奈米世界

  撰文者:謝佳龍 (中央研究院原子與分子科學研究所助研究員)  2016-11-23
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摘要

物理科學是研究奈米尺度下生命科學的重要基礎。透過光學量測,科學家能夠在對生物系統造成最小干擾的情況下,遠距離觀察活體現象。光學顯微影像技術所得到的資訊具有時間及空間解析度,這對探究生物系統中複雜行為非常有幫助。這樣獨特的研究方法,除了能夠提供許多推論最直接的實驗證據外,光學觀察也常常發現意想不到的現象。近年來,結合尖端物理、化學和工程的技術,光學顯微鏡的時間和空間解析度突飛猛進。本文將特別介紹目前世界最高速的精密光學單粒子追蹤技術,以及其在生物科學的應用。


光學顯微鏡一直是人類研究科學的重要工具,藉由各種特殊設計的光學量測系統,科學家們試圖透過觀察的方法,提供最直接的科學研究證據。「有圖有真相」可以算是光學顯微影像最貼切的註解。的確,一張顯微影像所提供的資訊,往往勝過千言萬語,一部由許多顯微影像組成的影片,其中同時包含的空間以及時間的資訊,更是探究複雜科學系統中不可或缺的研究工具。在許多科學領域中,生命科學始終高度仰賴光學顯微技術,這包括了幾個原因,首先,生命科學的研究對象時常是活生生的生物樣品,光學顯微量測的侵入性低,可以在一段距離外,以不干擾生物系統運作的前提下,靜靜地紀錄觀察。此外,一般光學顯微鏡的解析度在一個微米左右,這樣的解析度已經能夠解析單一細胞的形貌,對於要觀察大部份的生物系統十分足夠。而近年來發展的超解析度光學顯微鏡[1],更將解析度提升至數十奈米,細胞內的細微結構也無所遁形。另外,為了在顯微鏡底下更清楚看見所關心的研究對象,各式螢光標記以及超靈敏光偵測器的技術應運而生,現在科學家已經能夠在光學顯微鏡底下,透過螢光標記的方法,在細胞裡「看見」單一分子的運動。光學顯微技術在近年來的突飛猛進,為研究生命科學提供了絕佳利器,人類幾乎能夠將一個生物細胞在分子的解析度下看得清清楚楚,這不僅是技術上的突破,同時也讓我們有機會瞭解生命是如何由各個單一分子建構而成。在生物系統中,幾乎所有反應和功能的啟動,都是仰賴分子與分子的交互作用,若能看見分子在何時何地發生交互作用,將能回答許多生物現象根本的原理和機制,同時也將釐清許多疾病的成因和治療的方法。

然而,當科學家野心勃勃的想透過光學顯微鏡探究生物系統時,卻發現仍然有許多美中不足的地方。若想看清楚一個生物細胞中單一分子的運動,最讓人遺憾的,應該是光學顯微技術有限的時間解析度。一般光學顯微鏡每秒鐘可以提供數十張顯微影像,這對於研究單分子的運動是十分不足的。由於分子的體積很小(數奈米至數十奈米),在生物系統中每個分子都因為熱擾動不斷的受到周圍的分子碰撞而運動,這樣的運動稱之為擴散(diffusion)。擴散運動的方向和速度是隨機的,描述擴散快慢的物理量是「擴散速率(diffusion coefficient)」,擴散速率由環境的黏滯係數和溫度,以及擴散粒子(分子)的體積決定:

,                           (1)

式子中D為擴散速率,kB為波茲曼常數,T為絕對溫度,為黏滯係數,r為粒子的等效半徑(值得一提的是,擴散速率和粒子的質量無關)。舉例來說,一個直徑10奈米大的蛋白分子在水溶液中的擴散速率約為50 微米2/秒。這樣的擴散速率有多快呢?若是使用每秒100張的光學顯微鏡拍攝(即每張10毫秒),該分子在相鄰兩張影像之間平均一維移動距離是1000奈米(,t為時間間格),這對分子而言是非常遠的距離,同時意味著在每10毫秒的曝光過程中,分子已經和鄰近分子經歷許多次的碰撞與交互作用。若希望分子在觀察時間內只移動分子本身的大小(10 奈米),拍攝速度就必須達到每秒一百萬張(對應數十微秒的時間解析度)!真的有辦法可以拍攝這麼高速且精準的單分子影片嗎?答案是肯定的!

若想評估超高速單分子追蹤的可能性,我們得從追蹤的原理開始談起。首先,為了在顯微鏡底下看見分子,常用的技巧是將一個「發亮的標記」連接在想追蹤的分子上,所謂「發亮的標記」,廣義地來說,是該標記會發出比環境更多的光,因此可以在光學顯微鏡下「看見」它。能夠達到這個效果的標記種類很多,生物影像最常使用的是具有高轉換效率的螢光(fluorescence)分子。由於光的繞射特性,每一個點光源在遠場(far field)看起來都是繞射極限的光點,這個光點大小由光學影像系統決定,一般情況下光點最小約是在半個光波長左右,在可見光的波段(400 奈米至700 奈米),這意味著數百奈米大的光點。當標記在空間的密度足夠低,光點與光點之間不發生重疊的前提下,每個光點都獨立在空間中存在,我們便可以透過影像分析,找出每個光點的中心位置,因為這個定位方法適用於在空間中單一存在的標記粒子,所以這個技術又叫做「單粒子追蹤(single-particle tracking)」。

在單粒子追蹤技術中,「準確度」是評估效能的重要依據。簡單來說,若希望將粒子定位的越準,就需要越好的影像品質,而決定影像品質的最根本物理現象,是光子的散粒雜訊(shot noise)。什麼是光子的散粒雜訊呢?在一個假想實驗裡,一道光照射在光偵測器上,假設單位時間內平均有N個光子被偵測到(即單位時間內量測到的光子數期望值為N),然而每次量測到的真實光子數,會因為散粒雜訊而波動,使得有時候量到超過個光子,有時候少於N個光子(波動的標準差為)。這個波動不是因為量測設備不好,也不是因為光源不穩定,而是來自於光子根本的統計特性。在單粒子追蹤量測中,散粒雜訊導致的結果是使得影像品質不完美(如圖一),總光子數越少,影像的品質越差,追蹤的誤差也越大。其中,追蹤的誤差和光子數有一個簡單的關係[2]

,             (2)

其中是追蹤誤差,是光的波長。由此我們得知一個合乎直覺的結論:若想達到高準確度追蹤,基本要求便是要有足夠的光訊號(光子數)。舉例來說,如果希望在可見光500 奈米波長下把點光源在空間中定位到1 奈米準確度,所需要的光子數約在250,000。別忘了,這些光子只足夠將點光源準確的定位一次,為了持續追蹤,下個單位時間內仍需要等量的光子才能持續維持1 奈米準確度的追蹤。這樣的光訊號(光子數)的需求,對螢光分子來說是非常吃力的,原因說明如下。

圖一、考慮光子的散粒雜訊,當總光子數N越大,影像的品質越好。

螢光分子的發光過程中,牽涉到電子能階的躍遷。在完美的情形下,每次電子吸收激發光子至激發態,最後回到基態,便會放出一個螢光光子訊號。一般有機染料分子,在經歷一百萬次激發放光後,其分子結構就會被永久性的破壞,而無法再發光,這個現象叫光漂白(photobleaching)。考量每次1 奈米精準定位就需要數十萬個光子,一個染料分子所提供的總光子數只能夠用來做定位10次定位,這樣的定位次數對於研究生物系統的研究是十分不足的,這正是為什麼一般螢光的追蹤,寧可選擇較差的定位準確度,來換取較長的單分子軌跡。除了光漂白的問題,螢光還有飽和的限制。電子在激發態的生命週期,通常在1 ns至10 ns,這表示一秒鐘之內,在提供足夠激發光的情況下,電子最多可以經歷一億至十億次躍遷,放出一億至十億個光子。所以,即使螢光分子不會光漂白,一秒鐘內最多可以提供大約一千次定位,也就是時間解析度1毫秒。實作上,還有許多技術上的困難,例如非完美的螢光量子產率(quantum yield)和光學系統有限的收光效率(collection efficiency),都大大折損了螢光單分子的時間空間解析度,目前室溫下螢光單分子追蹤最高的時間空間解析度是在每秒2000張影像拍攝下,達到21 奈米追蹤準確度[3]

為了追求更高的時間空間解析度,科學家嘗試利用不同的發光方法來進行單粒子追蹤。其中最為成功的例子,便是利用線性散射(linear scattering)光作為訊號。當一個粒子的折射率和周圍環境不同時,在光的照射下便會將部分的光散射。有別於螢光,散射光訊號穩定,其訊號強度可以透過增加照射光強度線性增加,所以螢光的光漂白和飽和問題得到解決。雖然被線性散射的光的波長與照射的光相同,但在許多方面都可能與照射的光不同,例如光行進的方向,相位,甚至極化方向。只要偵測的方式設計得宜,便可以將散射光從照射光中區別出來。

舉例來說,暗視野顯微鏡(dark-field microscopy)透過特殊的光學設計,將照射光和散射光從空間中分隔出來,偵測器只量測散射光訊號,所以每個粒子都像發光的點光源。儘管如此,若只是靠偵測散射的訊號,仍然很難在超高速下偵測奈米粒子的散射訊號,困難來自於目前科技的限制:高速光偵測器本身會產生較高的電子雜訊,使得在超高速偵測時,電子的雜訊往往遠大過於散射的光子訊號。為了克服這個問題,一般實驗會試著用較大的粒子來提供更多的散射訊號,然而在很多生物研究中,用來標記的散射粒子有尺寸的限制,過大的粒子(直徑>40奈米)會干擾被標定的分子的運動行為[4]

幸運的是,線性散射有一個關鍵的特性,讓我們可以繞過電子雜訊的問題,完成高速且精準的量測,那個特性就是它與照射光之間的「同調性(coherence)」。所謂同調性,指的是具有穩定的相位關係。線性散射光和照射光的頻率相同,相位關係穩定,這提供了干涉式偵測散射訊號(interferometric scattering (iSCAT) detection)的可能[5]。干涉式偵測的原理,是創造一個和欲偵測的訊號同調的參考光(reference),這在線性散射中十分容易,只需將部分的入射光分出來作為參考光即可。接著在偵測器上將參考光和散射訊號空間上重疊,創造兩者之間的干涉。於是在光偵測器上的光子數為:

             (3)

式子中包括參考光NR,散射光NS,以及它們的干涉(為參考光和散射光的相位差)。通常為了將干涉訊號最大化,會選擇或者。當使用奈米粒子作為標記時,因為散射光很弱(遠小於參考光,即),所以干涉的訊號(式子(3)中的第三項)遠大於散射光(式子(3)中的第二項)。不同於暗視野顯微鏡試圖偵測微弱的散射光,干涉式散射顯微鏡偵測的干涉訊號遠大過於散射光本身。定量上來說,奈米粒子的散射光強度和粒子在光照下的極化性(polarizability)平方成正比,也因次跟體積的平方成正比,所以當粒子的體積變小至奈米尺寸時,散射光強度衰減得非常快,使得偵測變得困難。然而對干涉訊號而言,訊號強度和極化性成正比(而非平方正比),所以當粒子體積縮小時,干涉的訊號衰減較慢,也因此較有機會偵測到從小粒子散射出的訊號。

干涉式偵測還有一個絕佳的特性,就是確保量測擁有最接近理想的訊雜比(signal-to-noise ratio, SNR)。在完美的情況下,量測的雜訊只來自於光子的散粒雜訊,然而在高速量測下,偵測器的電子雜訊遠高過光子的散粒雜訊。干涉式偵測讓我們有機會即使使用高電子雜訊的偵測器,仍然可以不受限於該電子雜訊,達到只受限於光子散粒雜訊的靈敏量測[6]。這是怎麼做到的呢?

首先,在量測中,雜訊包含電子雜訊和光子散粒雜訊。當這兩種雜訊同時存在時,等效的雜訊強度可視為。在干涉量測中,因為參考光遠強過於散射光,所以光子的散粒雜訊主要來自于參考光的散粒雜訊(),而且當參考光足夠強的時候,該光子散粒雜訊甚至遠高過電子雜訊(),這個現象在一般的高速偵測器皆可達到。在這樣的情況下,雜訊主要就是由參考光的散粒雜訊為主。這也許會讓你感到疑惑,參考光製造的更大的雜訊,這要如何幫助達到更好的訊雜比呢?有趣的是,在干涉量測中,干涉的訊號強度也會因為參考光的存在而增強。最終訊雜比可以寫成

                 (4)

從式子中可以發現,只要參考光足夠強(使得參考光的散粒雜訊遠大過於電子雜訊),訊雜比只跟散射訊號強度NS和相位差有關,跟電子雜訊完全無關。這表示即使使用高電子雜訊的高速光偵測器,只要有足夠的參考光跟微弱的散射光干涉,最終干涉訊號的訊雜比,只由訊號光的強度決定。在固定訊號強度的情況下,這是最接近理想的量測。

利用以上介紹的干涉式偵測,我們能夠在顯微鏡下拍攝奈米粒子的高速運動。我們使用雷射當作光源,透過顯微鏡的物鏡把光投射到樣品上(如圖二a),樣品中的奈米粒子會散射部分的雷射光,在我們的系統中,背向散射光(backscattering)即是我們欲偵測的訊號。有很多方法可以取得干涉所需的參考光,一個方便的方法是把從支撐樣品的玻片反射的光作為參考光(如圖二b)。這個反射光和奈米粒子的背向散射光可以同時被顯微鏡物鏡接收,然後一起投影到高速相機上(如圖二a)。在相機上,參考光和散射光訓號干涉,當破壞性干涉發生時(),每一個奈米粒子皆形成一個暗點(如圖二c)。即使在超高速拍攝下,例如每秒五十萬張,影像的品質仍然維持在最佳狀態。目前超高速攝影機的技術,已經能夠每秒截取一百萬張影像。實作上,目前單粒子追蹤技術的紀錄是把一個20奈米直徑的金粒子,在每秒五十萬張的超高速拍攝下,將其中心位置作準確度2奈米的定位[6]

圖二、利用干涉的方法,在高速下偵測奈米粒子的微弱散射訊號。(a) 干涉式散射顯微鏡示意圖。(b) 利用蓋玻片的反射,作為參考光,與來自奈米粒子的背向散射光產生干涉。(c) 20奈米金粒子的干涉影像,影像擷取速度為每秒五十萬張,暗點來自於背向散射與反射光之間的破壞性干涉。

這樣一個超高速且超精準的追蹤技術,開啟了許多過去所無法進行的單分子生物研究。例如,當把奈米粒子標記在細胞膜中的脂質分子上時(如圖三),便可以看見該分子如何在細胞膜中運動。量測的運動軌跡,直接反映了細胞膜的結構和調節機制,當量測具有超高時間及空間解析度時,我們便有機會看到細胞膜中分子與分子的交互作用。

圖三、將金奈米粒子標記在細胞膜中的單分子上,用以觀察細胞膜的動態和物理性質。

影片一便是在每秒五萬張的高速拍攝下,金奈米粒子在仿生細胞膜上運動的行為(軌跡如圖四a)。這個仿生細胞膜因為組成簡單,所以可以視為均勻的二維環境,脂質分子在均勻的細胞膜中,便是遵循熱擴散的布朗運動。我們可以從許多統計的分析中檢驗所紀錄的軌跡是否真是布朗運動,例如它單位時間內的位移分布的確滿足常態分佈(圖四b),以及平均平方位移(mean square displacement (MSD))隨時間線性增加(圖四c)。

圖四、使用奈米粒子作為標記,在高速下(每秒五萬張)追蹤脂質單分子在膜中的運動。(a) 擴散運動軌跡。(b) X和Y方向上每20微秒的位移分布,皆滿足平均為零的常態分佈。(c) 平均平方位移,與時間間隔呈線性正比。

你或許會有疑問,金奈米粒子雖然很小(直徑20奈米),但脂質分子(大約1奈米)更小,用金奈米粒子標記脂質分子,難道不會影響脂質分子原有的運動行為嗎? 事實上,雖然金奈米粒子的體積遠大於脂質分子,金奈米粒子和脂質分子周圍環境的黏滯係數大不相同:水的黏滯係數大約是脂雙層膜黏滯係數的百分之一。所以,儘管金粒子體積較大,但它在水裡的擴散速率,其實比脂質分子在膜裡的擴散速率來得大,也因此金奈米粒子對脂質分子所造成的水動力負載(hydrodynamic loading),是幾乎無法改變脂質分子的擴散行為的。

除了細胞膜方面的研究外[7],近年來利用金奈米粒子和超高速影像,科學家們也在其他領域陸續發現了許多單分子在奈米尺度下的微妙行為。例如將奈米粒子標記在驅動蛋白(motor protein)上[8],便可以觀察驅動蛋白是如何透過分子結構在奈米尺度的改變,巧妙地完成如同機械般精準的運動,進而達成在細胞內傳遞物質以及其他維持生命所需的運動。

透過尖端光學顯微鏡的觀察,我們開始了解生命在最小尺度下是怎麼運作的,然而,這些都只是一個開始:儘管知道運作的原理,這些分子的精細設計和結構,是現今人類科技所無法創造的。分子與分子之間的交互運動,看似隨機又漫無目的,但實際上確是亂中有序。生命便建立在這一個個「隨機」事件上,形成一個可靠又龐大的複雜系統。若能夠駕馭這樣的複雜系統,人類的生物醫學文明,必定能向前跨一大步。在奈米的世界裡,生物,物理,化學這些學科的界線開始變得模糊,唯有透過結合跨領域的知識,才能掌握各個環節,獲取新一代的科學學問。


參考文獻

1. 張宜仁and 周家復, "超解析度光學顯微術簡介," 物理雙月刊3765-78, (2015).

2. R. E. Thompson, D. R. Larson, and W. W. Webb, "Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes," Biophys. J. 82 2775-2783, (2002).

3. R. Tero, G. Sazaki, T. Ujihara, and T. Urisu, "Anomalous diffusion in supported lipid bilayers induced by oxide surface nanostructures," Langmuir 27 9662-9665, (2011).

4. P. Mascalchi, E. Haanappel, K. Carayon, S. Mazères, and L. Salomé, "Probing the influence of the particle in Single Particle Tracking measurements of lipid diffusion," Soft Matter 8 4462-4470, (2012).

5. J. Ortega-Arroyo and P. Kukura, "Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy,"Phys. Chem. Chem. Phys. 14 15625-15636, (2012).

6. Y.-H. Lin, W.-L. Chang, and C.-L. Hsieh, "Shot-noise limited localization of single 20 nm gold particles with nanometer spatial precision within microseconds," Opt. Express 22 9159-9170, (2014).

7. H.-M. Wu, Y.-H. Lin, T.-C. Yen, and C.-L. Hsieh, "Nanoscopic substructures of raft-mimetic liquid-ordered membrane domains revealed by high-speed single-particle tracking,"Scientific Reports 6 20542, (2016).

8. H. Isojima, R. Iino, Y. Niitani, H. Noji, and M. Tomishige, "Direct observation of intermediate states during the stepping motion of kinesin-1," Nat. Chem. Biol. 12 290-297, (2016).


謝佳龍 (中央研究院原子與分子科學研究所助研究員)



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