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光學顯微術的極限運動

  撰文者:陳思妤 (中央大學光電系副教授)  2016-11-23
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人類是一種熱愛挑戰極限的生物,越是不可能就越要試試看,這才造就了現今科技的非凡成就。

繞射極限

還記得在高中學習透鏡的基本光學特性時學到,若讓一束平行光穿過凸透鏡,光束就會完美的聚在焦點上,當時奉為圭臬的準則到了大學的課堂上卻不再堅若磐石—光,其實並不會聚成一個點。基於光的波動特性,當一個點光源的光經過一個具有有限孔徑的透鏡時,成像面上的光點會因光波在邊界上的繞射行為而具有一同心圓的強度分布(圖1(a)),此強度分布的中心亮區稱為艾瑞盤(Airy disk),外圍的同心環則稱為艾瑞斑(Airy pattern),而此聚焦點的三維強度分布則稱為點擴散函數(point spread function)。如果光能聚成一個完美的點,兩個光點不管靠得多近都能被分辨出來,但實際上兩個成像面的光點卻會因互相重疊而無法分辨,根據瑞利準則(Rayleigh criterian)的定義,當其中一個光點的峰值重疊到另一光點的第一零點時,此距離為兩光點能被分辨的最短距離,即為此系統的解析度(圖1(b)),而1873年德國科學家阿貝(Ernst Karl Abbe)則進一步提出在繞射特性的限制下此解析度的極限可描述為

                          (1)

此解析度又被稱為繞射極限(diffraction limit),其中為波長,nsin為系統的數值孔徑。

圖1. (a)艾瑞盤(中心亮區)及艾瑞斑(同心環);(b)瑞利準則定義下的解析極限d[1]

在物理的限制下,各式各樣的光學系統如眼睛、相機、及顯微鏡等都有其繞射極限,既是物理的極限自然就無法直接在物理上突破它,但山不轉路轉,不能爬過這座山,繞過總行吧!在所有光學系統中最講究解析度的就是光學顯微鏡了,為了能滿足人類對微觀世界的好奇心,顯微術的開發者不斷地在追求著解析度的提升,而在即將進入21世紀時,有數個研究團隊不約而同的提出了將解析度進一步提升到繞射極限之上的方法,統稱為超解析度顯微術(superresolution microscopy),每個方法都極具巧思及創意,經過近二十年的研究,衍伸出來的方法更是不勝枚舉。歸納這些提升解析度的方法,最常見的有三大類型,這邊就帶大家一窺這個世界的精緻與巧妙。

結構照明顯微術(Structured illumination microscopy, SIM)

不管是平常看東西、拍照還是使用顯微鏡,大家都希望照在物體上的光是明亮而均勻的,這樣才能看清楚我們的目標物,但是,不均勻的光真的就不好嗎?1998年Rainer Heintzmann發表了一篇透過結構照明(structured illumination)來得到超解析度的文章,利用了一個平常在日常生活中也常見到的現象—莫列波紋(Morié pattern)。如圖2中的範例所示,如果將一組條紋重疊到一張條紋上,在重疊的圖像中會出現橫向的亮暗紋,但條紋的週期會較原本圖像上的結構來得大,同樣的現象也會出現在透過低解析度影片看穿著細條紋衣服的演員時,這是因為空間上取樣過低(undersampling)而造成的效應,讓我們看不清物體原本的結構。

圖2. 將兩組條紋重疊在一起可產生週期較低、變化較慢的莫列波紋。

為什麼透過結構照明能得到超解析度呢?首先要先來了解超解析度的定義。在一個光學系統中,繞射極限定義出了系統所能解析出的最小距離,若以空間頻率來說,就是系統能解析出的最高空間頻率,若能讓系統可觀察的最高空間頻率進一步提高,就能得到具有超解析度的影像。而要怎麼接收到更高的空間頻率資訊就是結構照明的精巧之處了!當我們將一具有條紋的照明打在被觀察物上時,根據前面所述的莫列現象,物體上的高頻資訊會因照明條紋而被轉換為較低頻的資訊(此處所指的頻率皆為空間頻率),因此能夠被光學系統所記錄,就像是先編碼再解碼的概念,這些被記錄的低頻資訊可以透過數學方法再還原出當中所包含的高頻資訊,如此一來就能如木馬屠城計一般將高頻資訊偷偷帶進影像中,讓影像的解析度進一步的提升到繞射極限之上。

換個角度從頻率空間來看結構照明的概念。以圖3(a)的物體為例,圖3(b)是這個物體所具有的空間頻率分布(註:為利於介紹,此空間頻率分布與物體並未直接相關),經光學系統所得到的頻率資訊會因繞射極限而被侷限在一個範圍內(圖3(c)),影像會因此而變得模糊(圖3(d)),這個範圍即由點擴散函數在頻率空間所對應的函數—光傳遞函數(optical transfer function, OTF)—所決定,最高可得到的空間頻率稱為截止頻率(cut-off frequency)。如果將照明換成了結構照明(強度變化為一弦波函數),則光學系統所得到的影像會呈現像圖3(e)中的分布,其對應的空間頻率分布則如圖3(f)所示,當中除了原本圖3(c)中的成分A外,原本圖3(b)中的頻率資訊會分別往正負頻率方向平移而產生B和C兩組頻率資訊,而位移的量即為照明條紋的空間頻率。注意到了嗎?這些被平移進來的成分帶入了圖3(c)中沒有的高頻資訊!如果我們能從影像中把A、B和C三個成分分離出來,就能取得這些高頻資訊而提升影像的解析度。

圖3. (a)待測物體和(b)該物體所對應的空間頻率分布;(c)在經過光學系統後被OTF所限制的空間頻率分布和(d)其所對應的影像;(e)在結構照名下所取到的條紋影像和(f)其所對應的空間頻率分布,其中A為圖(c)中的頻率成分,而B、C分別為向正負頻率方向平移後的頻率成分。

為了將高頻資訊從低頻資訊中還原出來,在執行結構照明時必須要連續取得三張條紋影像,而且三張影像中的條紋必須有位置上的平移,就像在解聯立方程式一樣,用三條方程式來解出A、B和C三個成分,得到這三個成分後再像拼拼圖一樣把它拼回去,就能達到我們的目的了(圖4(a))。同樣的做法可以用不同方向的條紋重複數次,如此可以拼出更多方向的高頻資訊,讓影像在各個方向上的解析度都能有所提升(圖4(b))。在系統光傳遞函數的限制下,照明條紋所能具有的最高空間頻率即為系統的截止頻率,因此在影像重建後,影像所含有的頻率範圍最大可被擴充至原本的兩倍,解析度最大可被提升兩倍。但此限制並非不可突破,若將照明的強度提升至使螢光分子產生激發的飽和,則可使照明條紋等效上產生更高空間頻率的成分,如此一來可產生兩倍、三倍、甚至更高倍條紋頻率的位移項,目前最高紀錄可將解析度提升為原本的五倍[2]

圖4. (a)將解出來的B、C兩項分別往負正方向平移回去再與A項拼接所得到的頻率分布;(b)分別使用三組不同方向的條紋所重建回來的頻率分布。

為了要在樣本上產生結構照明,最早所採用的方法是將兩道雷射光束以不同角度入射並重疊在樣本上產生干涉條紋,後來為了提高條紋的穩定度並降低系統的複雜度,各種做法不斷的被提出,如使用DMD (digital micromirror device)及SLM (spatial light modulator)等二維調制器來對照明光進行空間上的強度調制[3],系統的速度及穩定度也大幅提升至可商品化的程度。在傳統的結構照明系統的架構下,縱向上的解析度並未獲得改善,因此只限於用來觀察厚度在10 mm以下的樣本,為了能將結構照明的技術擴充到厚組織的應用上,有團隊使用了三道雷射光來干涉產生縱向上的照明條紋[4]或直接利用結構照明本身所具有的光學切片能力[3],亦有團隊結合其他光學切片技術如共軛焦或雙光子顯微術等來改善系統在縱向上的解析能力[5]。圖5為傳統廣域照明顯微術與三維結構照明顯微術(3D SIM)在同一樣本上的比較,此結構照明系統採用了三道光進行干涉,不僅橫向的解析度被提升,縱向上的結構更能清晰的辨識。

圖5. (a)(b)為傳統廣域照明(WIDEFIELD)與三維結構照明顯微術(3D SIM)影像的比較,可明顯比較出解析度的提升[6]

結構照明除了提升解析度的能力外,還具有光學切片(optical sectioning)和三維表面重建(3D profiling)的功能,應用層面相當廣泛,雖然在取樣上會用掉較多的時間,卻能結合到不同的影像系統上,是一種可變性相當高的技術,也因此即使過了二十年,在新型結構照明系統的開發上依然熱度不減!

受激輻射耗乏顯微術(Stimulated emission depletion microscopy, STED)

看完前面極具巧思的結構照明後,接下來要看一種簡潔而直觀的方法。如前面所說,決定解析度的是光學系統聚焦點(點擴散函數)的大小,而繞射極限則是來自於系統所能產生的最小的聚焦點,如果我們能讓這個聚焦點變得更小,解析度就能再進一步提升。但,物理告訴我們,基於光的繞射特性聚焦點不可能再變得更小,那該怎麼做呢?試想一個狀況,當一束光打在一片白色的牆面上,我們能透過牆面的散射而看清楚整束光的輪廓,但若我們將光束照射在一個比光束還小物體上,就會因產生散射的區域變小而只看到部分的光束,雖然光束本身沒有變化,但等效上就像是光束被縮小了,1994年Stefan W. Hell所提出的受激輻射耗乏顯微術(STED microscopy)就是採用了這種概念[7]

STED顯微術是一種專為螢光(fluorescence)所設計的系統,利用了螢光能被關閉的特性來減小等效聚焦點的大小,而用來關閉螢光訊號的機制就是受激輻射(Stimulated emission),這邊就先來了解一下螢光和受激輻射產生的機制:分子吸收了光子的能量後會躍遷到較高的能量態,當分子由高能態回到低能態時,就會將能量轉換為光子釋出,此光子即稱為螢光,在光譜表現上為一寬頻訊號;相較於螢光的產生,如果分子還在高能態時即接收到與螢光光子能量相當的光子,那麼分子就會產生出與這顆光子能量相同的光子,這個過程就稱為受激輻射在光譜表現上為一窄頻訊號(圖6)。在STED系統中會有兩道雷射光一起打在樣本上,其中第一道光會聚成一個圓點,用來激發樣本中的螢光,可稱為激發光(excitation light),而第二道光除了會聚成一個甜甜圈的形狀外,還會特別將波長挑選在螢光光譜的範圍內,用來進行螢光分子的受激輻射,可稱為耗乏光(depletion light),當兩道光重疊打在樣本上時,激發光外圍的螢光分子會因為耗乏光的激發而產生受激輻射,相較而言,激發光的中心區域在沒有受激輻射的狀況下則產生寬頻的螢光訊號,此時利用帶通濾波片(bandpass filter)將受激輻射的訊號濾除,則可保留中心激發區域的訊號,讓等效的激發區域變小,如此以來可視為等效的點擴散函數變小而達成影像解析度的提升(圖6)。

圖6. STED顯微術的概念示意圖。當激發光與耗乏光疊合在樣本上時,外圍會產生受激輻射而中心區域則放出寬頻的螢光訊號,經由帶通濾波器的濾除後可得到等效縮小的點擴散函數。

在實際的執行上激發光會選擇為赫米-高斯的基礎模態(TEM00 mode),而耗乏光則選擇為拉蓋爾-高斯的01*模態(TEM01* mode),當激發光固定時,如果耗乏光的強度越強,則等效點擴散函數的半高寬越窄,解析度越高,此外,提高螢光分子受激輻射的效率也能增加解析度的提升。為了增加受激輻射的效率,通常會選擇脈衝雷射來做為激發光和耗乏光[7],雖然後來也發展出以連續波雷射來執行的系統[8],但若要達到相同的效率,在雷射光強度上的需求則相對偏高;另一方面,因為受激輻射的生命期(lifetime)較螢光的生命期短上許多,如果在訊號的擷取上加入恰當的時間閘(time gate) [8],只收取受激輻射結束後的訊號,也可以進一步排除受激輻射的影響,等效提高受激輻射的效率。早期的STED開發主要聚焦於橫向(lateral)解析度的提升,爾後因為相位調制技術漸趨成熟,開始能夠同時產生橫向及縱向上的耗乏光,就像是個三維的空心球一樣,可以同時提升三維的解析度。圖7中的兩圖分別為傳統共軛焦顯微術(confocal microscopy)與3D STED顯微術在同一樣本上的比較,相較於原本就具有光學切片能力的共軛焦顯微術,3D STED在橫向及縱向上都能達到解析度的提升[9]。因為此技術對於解析度提升上的貢獻,2014年Stefan W. Hell 和另外兩位科學家Eric Betzig和William E. Moerner共同獲頒了化學諾貝爾獎。

圖7. 3D STED與共軛焦顯微影像之比較,橫向及縱向解析度都有明顯的提升[9]

光活化定位顯微術(Photoactivated localization microscopy, PALM)及隨機光學重建顯微術(Stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)

在前段STED的介紹中提到可以用減法的概念來縮小點擴散函數的大小,如果換個角度來看解析度與點擴散函數大小的關係,隱藏在其背後的原因其實是因為螢光分子的密度太高了!透過圖8(a)的示意圖可以看出,當分子間的距離很小時,每個點擴散函數的範圍內總是能包含超過一個以上的螢光分子,而在此範圍內的分子都無法在影像中被解析,因此造成了解析度的不足,如果我們能讓分子間的距離都大於點擴散函數的範圍,那每個分子都能被完美的解析(圖8(b))。STED系統的概念是透過縮小點擴散函數的範圍來提高解析度,而1995年Eric Betzig提出的想法則是要透過增加螢光分子間的距離來達到相同的目的。然而要控制螢光分子的分布是不容易做到的,因此一直到2002年Jennifer Lippincott-Schwartz發現了某種綠螢光蛋白能藉由光照來控制其開關時,Eric Betzig才真正實現了他的想法。

圖8.螢光分子(a)密度高及(b)密度低時與點擴散函數的關係示意圖。

此種可藉由光照來開關的螢光分子稱為可光活化螢光分子(photoactivable fluorophore),以綠螢光蛋白為例(圖9),此種分子可透過413 nm活化光的照射而進入活化狀態,被活化的分子可經由488 nm激發光的照射而產生螢光,但長時間或高強度的照射則會使分子被漂白而進入非活化狀態。利用此概念,Eric Betzig選用了低強度的活化光來隨機活化少量的螢光分子,接著以激發光激發這些分子的螢光並進行記錄,因為這些被活化的分子會隨機而分散地分布,彼此間的距離可大於點擴散函數的範圍,故而在螢光影像上的每個成像點都能被視為單顆分子的影像,能藉此找出並記錄這些分子所在的位置,而因為每次被活化的分子都是隨機的,在重複執行夠多次活化、激發、記錄的週期後我們將可透過統計的結果來得出螢光分子的分布圖(圖10)。這種方法採用了可光活化螢光分子的概念,因此稱為光活化定位顯微術(PALM) [10],此種技術的解析度限制與前兩種技術不同,主要來自於被活化分子的離散程度以及定位的準確度,離散程度越高或定位誤差越小都能得到越高的解析度,一般可達到20 nm的極高解析度,能與STED媲美,但唯一限制來自於此技術需要相當多次的取像週期,在取像上較不如STED系統來的即時。

圖9. 綠螢光蛋白可經由413 nm的照射被活化而能以488 nm激發螢光。

圖10. PALM及STROM系統的概念示意圖。(a)為物體中的螢光分子分布;(b)-(e)為不同週期中被開啟並記錄的螢光分子分布(綠色);(f)為經過多次週期記錄後統計所得的螢光分子分布圖。

而除了可光活化螢光分子能達到Eric Betzig的想法外,2006年Xiaowei Zhuang提出了另一個途徑,利用Cy5和Cy3組成一個可光切換(photoswitchable)的螢光分子對,可透過不同波長的照射讓此分子對在亮態(bright state)與暗態(dark state)之間做切換,亦可達到與PALM相同的效果,後來更有團隊提出利用有機螢光分子具有的光閃爍(photoblinking)特性來產生隨機的訊號,可降低系統的複雜度,並提高訊號的強度,這些方法被統稱為隨機光學重建顯微術(STORM)[11],雖然名字與PALM不同,但背後的概念是共通的。若要細細比較這兩種技術的不同,STORM所採用的光切換機制則較PALM不易有永久光漂白的問題,螢光可被開關的次數可大幅增加。STORM和PALM兩種技術都是透過對分子做定位來達到解析度的提升,若要得到三維的影像(3D-STORM)就要同時對分子做縱向的定位,因此必須讓不同深度的螢光分子訊號能具有顯著的差異,最常見的做法是利用光束經柱狀透鏡聚焦時會在縱向上產生連續光形變化的特性,基於光形與縱向深度的關係,經由分析來定位出分子所在的深度[12]。圖11為傳統廣域照明顯微鏡與3D-STORM系統在同一樣本上的比較,與前述SIM和STED不同的是,3D-STORM影像是由一堆分子所在位置的統計點所組成的,因此在影像上看不到點擴散函數直接的影響,而訊號的強度則是由統計點出現機率的大小所決定。

圖11. (a) 3D-STORM影像;(b)傳統廣域顯微術和(c) STORM影像之比較[12]

結語

在經過許多科學家及研究團隊近二十年的努力下,光學顯微術成功地”繞”過了繞射極限的高山,將解析度推向了數十奈米的等級,由microscopy進到了nanoscopy的世界,顯微術不再只是顯”微”術,但科學家們卻不以此而滿足,持續的開發各種能超越極限的技術,希望能將超解析度的概念滲透到螢光之外的各種光學顯微系統中。這,就是光學顯微術界的極限運動!


參考資料

[1]       https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Airy_disk_spacing_near_Rayleigh_criterion.png

[2]       M. G. L. Gustafsson, “Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.” PNAS, 102, 13081-13086 (2005).

[3]       D. Dan, M. Lei, B. Yao, W. Wang, M. Winterhalder, A. Zumbusch, Y. Qi, L. Xia, S. Yan, Y. Yang, P. Gao, T. Ye, and W. Zhao, “DMD-based LED-illumination Super-resolution and optical sectioning microscopy.” Sci. Reports, 3, 1116 (2013).

[4]       M. G. L. Gustafsson, L. Shao, P. M. Carlton, C. J. R. Wang, I. N. Golubovskaya, W. Z. Cande, D. A. Agard, and J. W. Sedat, “Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.” Biophysical J., 94, 4957-4970 (2008).

[5]       C.-H. Yeh and S.-Y. Chen*, “Resolution enhancement of two-photon microscopy via intensity-modulated laser scanning structured illumination,” Appl. Opt., 54, 2309-2317 (2015).

[6]       http://www.platformtechnologies.org/_instrument/3d-structured-illumination-microscope/

[7]       S. W. Hell and J. Wichmann, ”Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.” Opt. Lett., 19, 780-782 (1994).

[8]       G. Vicidominia, I. C. Hernándeza, M. d’Amoraa, F. C. Zanacchia, P. Bianchinia, A. Diaspro,”Gated CW-STED microscopy: A versatile tool for biological nanometer scale investigation.” Methods, 66, 124-130 (2014).

[9]       http://abberior-instruments.com/products/superresolution-microscopes/easy3d/

[10]   H. Shroff, H. White, and E. Betzig, “Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.” Curr. Protoc. Cell Biol., Chapter 4, Unit 4.21 (2008).

[11]   M. J. Rust, M. Bates, and X. Zhuang, “Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) provides sub-diffraction-limit image resolution.” Nat. Methods, 3, 793-795 (2006).

[12]H. Ma, J. Xu, J. Jin, Y. Gao, L. Lan, and Y. Liu, “Fast and Precise 3D Fluorophore Localization based on Gradient Fitting.” Sci. Reports, 5, 14335 (2015).


陳思妤 (中央大學光電系副教授)



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